Il palazzo in cui ha sede la Galleria, fu costruito alla metà del Cinquecento dall'architetto Giorgio Vasari (1511-1574) nel periodo in cui Cosimo I de' Medici, granduca di Toscana, andava consolidando anche burocraticamente il suo dominio: in origine il palazzo fu destinato a contenere gli "Uffici" delle magistrature.
Nelle sale al terzo piano, in ordine cronologico, sono esposti dipinti dal secolo XIII al XVIII. La visita alla Galleria prosegue in un'altra sezione: nel famoso Corridoio Vasariano, costruito appunto dal Vasari nel 1565, per collegare gli Uffizi a Palazzo Vecchio e, attraversando l'Arno sopra il Ponte Vecchio, col Forte Belvedere e il Giardino di Boboli.
Al secondo piano con una raccolta di pitture, sculture e arazzi fu realizzata da Francesco I (1541-1587).
La galleria degli uffizi contiene migliaia di opere e rappresenta il simbolo della vocazione al collezionismo e mecenatismo dei signori della città e degli uomini illustri che l'hanno vissuta.
Anna Maria Luisa Medici, con la quale si estingue la famiglia Medici, dona la Galleria ai Lorena a condizione che divenisse un luogo aperto al pubblico.
L'ingresso sul lato est del piazzale degli Uffizi è attraverso lo Scalone Vasariano che porta al primo piano, dove si trovano le sale di esposizione e consultazione del Gabinetto dei Disegni e Stampe, una ricca raccolta di disegni di artisti come Leonardo da Vinci, Michelangelo, Pontormo, Vasari e tanti altri.